編輯推薦：大多數(shù)研究蛋白復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)都需要將這些蛋白復(fù)合物完整的放到質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，Kaltashov則采用了一種不同的方法，也就是稱為氫氘交換

    生物通報(bào)道：質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主力。這種技術(shù)方法能精確的檢測多肽，從而幫助研究人員識別并測序多肽分子，分析它們的特征，了解它們?nèi)绾芜M(jìn)行化學(xué)修飾的。

    但大多數(shù)蛋白質(zhì)并不是單獨(dú)行動的，一些關(guān)鍵的生物學(xué)過程，如DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分裂和能量生成都依賴于大型蛋白復(fù)合物的行為，這些蛋白復(fù)合物常常涉及幾十個(gè)亞基，十分復(fù)雜，傳統(tǒng)的質(zhì)譜方法難以進(jìn)行研究。為此研究人員不斷改進(jìn)質(zhì)譜技術(shù)，希望能通過技術(shù)改進(jìn)來解決這個(gè)問題：

    前篇：質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)相互作用（一）

    繪制蛋白-蛋白相互作用界面圖譜生物通

    研究員：麻省大學(xué)阿默斯特學(xué)院化學(xué)教授Igor Kaltashov

    研究項(xiàng)目：探討候選蛋白療法中蛋白與其分子靶標(biāo)的相互作用

    解決方案：

    大多數(shù)研究蛋白復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)都需要將這些蛋白復(fù)合物完整的放到質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，Kaltashov則采用了一種不同的方法，也就是稱為氫氘交換 (hydrogen-deuterium exchange，HDX)的技術(shù)。

    所謂氫氘交換質(zhì)譜方法，其原理就是將蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氫原子將于重水的氘原子發(fā)生交換，而且蛋白質(zhì)表面與重水密切接觸的氫比位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的或參與氫鍵形成的氫的交換速率快，進(jìn)而通過質(zhì)譜檢測確定蛋白質(zhì)不同序列片段的氫氘交換速率，從而得出蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)信息。

    除樣品制備外，氫氘交換質(zhì)譜法的主要過程包括：交換反應(yīng)、終止反應(yīng)、將蛋白快速酶切為多肽、液相分離、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)解析。氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、蛋白表位及活性位點(diǎn)鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用。

    Kaltashov 解釋道HDX還可以用于分析任何可能改變不同蛋白區(qū)域與其溶劑之間的可及性，比如蛋白質(zhì)折疊和聚集，還有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用?！耙坏﹥煞N蛋白質(zhì)彼此綁定，溶劑就無法接觸到其相互作用的界面，并將這反映到氫氘交換動力學(xué)上來，”他說，這種改變比較于單個(gè)蛋白十分明顯。

    在2009 年的一篇綜述中，Kaltashov介紹了轉(zhuǎn)鐵蛋白（一種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）與其受體的這種過程，經(jīng)過交換反應(yīng)后，蛋白會被打碎成多肽，然后逐段分析。他說，一些多肽顯示并未出現(xiàn)氫氘交換，這表明這些多肽由于被埋在蛋白核心當(dāng)中，因此不會曝露在溶劑中。其它的多肽盡管有受體綁定，但是出現(xiàn)了與溶劑相同速度的氫交換，因此它們并不是蛋白-受體界面的組成部分。

    還有第三種多肽，在存在和缺少受體的情況下，表現(xiàn)出明顯的差異，這些多肽就是蛋白-蛋白相互作用的位點(diǎn)(Anal Chem, 81:7892-99, 2009)。

    “實(shí)際上你可以定位出這些位點(diǎn)，了解相互作用結(jié)合的強(qiáng)度信息，以及界面區(qū)域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，”Kaltashov 說。

    需要注意二硫鍵：

    如果你希望嘗試bottom-up的HDX實(shí)驗(yàn)，那么就要小心二硫鍵，Kaltashov 說。胃蛋白酶能有效的在HDX實(shí)驗(yàn)中將蛋白消化成組成多肽，但如果出現(xiàn)多個(gè)二硫鍵時(shí)就會造成麻煩。

    2014年，Kaltashov 的實(shí)驗(yàn)室對這一問題發(fā)表了兩種解決方案。第一次采用一種叫做電子捕獲裂解 (electron capture dissociation ，ECD) 的片段化技術(shù)（Anal Chem, 86:5225-31, 2014）；另外一種澤斯跳過胃蛋白酶消化這一部，這也就是top-down 分析方法 (Anal Chem, 86:7293-98, 2014)。